二、疫情报告和诊断（2）

(二)实验室诊断

1.组织病理学诊断

组织病理学诊断是观察组织学病变(或称为显微病变)。

有些疫病引起的大体病变不明显或缺如，或不同疫病具有相同的解剖变化，仅靠肉眼很难做出判断，还需作组织病理学检查才有诊断价值，例如传染性海绵状脑病、鸡马立克病与白血病等。

有些病还需检查特定的组织器官，如疑为狂犬病时应取脑海马角组织进行包涵体检查。

2.微生物学诊断

微生物学诊断属于病原学诊断的范畴，是诊断动物传染病的最重要方法，常用诊断方法和步骤如下。

(1)病料的采集：

正确采集病料是微生物学诊断的重要环节。

病料力求新鲜，最好能在濒死时或死后数小时内采取；

应从症状明显、濒死期或自然死亡而且未经治疗的病例取材；

要求尽量减少杂菌污染，用具器皿应尽可能严格消毒。

通常可根据所怀疑病的类型和特性来决定采取哪些器官或组织。

原则上要求采取病原微生物含量多、病变明显的部位，同时易于采取，易于保存和运送。

如果缺乏临床资料，剖检时又难以判断疫病类型的可能范围时，应比较全面地取材，例如血液、肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等，同时要注意带有病变的部分。

如怀疑炭，则按规定方法取材。

(2)病料涂片、镜检：

通常把有显着病变的组织器官涂片数张，进行染色、镜检。

此法对于一些具有特征性形态的病原菌如炭疽杆菌、链球菌、巴氏杆菌等可以迅即做出诊断，但对大多数传染病来说，只能提供初步依据或参考。

(3)分离培养和鉴定：

用人工培养方法将病原体从病料中分离出来。

分离培养细菌、真菌、螺旋体等可选择适当的人工培养基，分离培养病毒可选用禽胚、动物或细胞组织等。

分得病原体后，再进行形态学、培养特性、动物接种(致病性)、免疫学及分子生物学等鉴定。

(4)动物接种试验：

有时人工培养分离到的微生物不一定是引起发病的病原体，因此需要选择对病原体最敏感的动物进行人工感染试验。

将病料用适当的方法处理并进行人工接种，然后根据对动物的致病力、症状和病理变化特点来帮助诊断。

当实验动物死亡或经一定时间剖杀后，观察体内变化，并采取病料进行涂片检查和分离鉴定。

一般常用的实验动物有家兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、家禽、鸽子等，当实验动物对病原体无感受性时，可以采用有易感性的本种动物进行试验，但对于大、中型动物或特种动物因费用高，而且需要严格的隔离条件和消毒设施，因此只有在必要和条件许可时才进行本种动物接种试验。

从病料中分离出病原微生物，虽是确诊的重要依据，但也应注意动物的“健康带菌(毒)”现象，其结果还需与临床及流行病学、病理变化结合起来进行综合分析。有时即使没有发现病原体，也不能完全否定该种传染病的诊断，因为任何病原学方法都存在有漏检的可能。

3.免疫学诊断

免疫学诊断是传染病诊断和检疫中最常用、最重要的诊断方法之一，它包括血清学试验和变态反应两大类方法。

(1)血清学试验：

可以用已知抗原来测定被检动物血清中的特异性抗体，也可以用已知的抗体(免疫血清)来测定被检材料中的抗原。

免疫学方法检测的抗原可以是完整的病原体，也可以是病原体的一部分。

根据实验原理，血清学试验可分为中和试验(毒素中和试验、病毒中和试验等)、凝集试验(直接凝集试验，间接凝集试验，间接血凝试验、协同凝集试验和血细胞凝集抑制试验）、沉淀试验(环状沉淀试验、琼脂扩散沉淀试验和免疫电泳等)、溶细胞试验(溶菌实验、溶血试验)、补体结合试验以及免疫荧光技术、免疫酶技术，放射免疫测定、单克隆抗体技术等。

近年来，因其与现代科学技术相结合(如蛋白感芯片、多肤芯片等)，血清学试验发展很快，在方法改进上日新月异，应用也越来越广，已成为传染病快速诊断的重要工具。

(2)变态反应：

动物患某些传染病（主要是慢性传染病)后，可对该病病原体或其产物(某种抗原物质)的再次进入产生强烈反应，即变态反应。

能引起变态反应的物质(病原体或其产物或抽提物)称为变应原，如结核菌素、鼻疽菌素等，将其注入患病动物时，可引起局部或全身反应，故可用于传染病的诊断。

4.分子生物学诊断

分子生物学诊断又称为基因诊断。

主要是针对不同病原微生物所具有的特异性核酸序列和结构进行测定。

自1976年以来，基因诊断方法取得巨大进展。

建立了dNA限制性内切酶图谱分析、核酸电泳图谱分析(如鸡传染性法氏囊病病毒、呼肠孤病毒等都有特征性电泳图谱条带)、寡核苷酸指纹图、核酸探针(Northern杂交、Southerm杂交、原位杂交、斑点杂交等)、聚合醇链反应(polymerase chain reaction, pcR)以及新近几年发展起来的dNA芯片(dNAchip)技术等。

在传染病诊断方面，具有代表性的技术主要有三大类：pcR技术、核酸探针和dNA芯片技术。

(1)pcR技术：

又称为体外基因扩增技术，诞生于1985年，由美国pE-cetus公司mullis等人发明，1987年得到美国专利局的专利授权。

它不仅在疾病诊断领域而且在整个生命科学领域都是应用最广泛、最受青睐的技术。

pcR技术用于传染病的诊断主要是检测病原核酸，不仅可以检测活的病原体，而且还可检出已灭活的病原体，甚至是存放多年的病理标本，只要病原体的核酸未降解。

因此，当由于各种原因无法进行病原分离与鉴定时(如人工方法不能培养或极端危险不宜培养)，该技术将发挥巨大作用，既克服了技术难题，又安全可靠。

传染病的病原体主要有真核生物、原核生物和非细胞型生物(病毒)三大类。

每类病原体都有其特异性的核酸序列。检测出特异性核酸就能确定致病的微生物，从而确诊是哪种传染病。

pcR技术具有高度敏感性和特异性，可从10?个细胞中检出一个被病毒感染的细胞，可将同一病原的不同毒株或菌株区分开来，这是一般诊断方法难以办到的。

同时，pcR方法简便、快速，目前已广泛应用到几乎所有传染病的检测。

另外，由pcR技术与其他技术相结合又衍生出一系列相关技术，如反转录pcR(Rt-pcR)、免疫pcR、抗原捕获pcR、毛细管pcR、套式pcR(Nested pcR)、重组pcR、多重pcR、荧光定量pcR等。

(2)核酸探针技术：

核酸探针又称为基因探针或核酸分子杂交技术。

该技术有三大组成部分：

待检核酸(模板)，固相载体(Nc硝酸纤维膜或尼龙膜)，同位素、酶或荧光材料等标记的已知核酸片段(探针)。

该方法敏感性高，检测一个单基因仅需10?拷贝，能检测出低至10ˉ13g dNA，用单抗方法则至少需要10\\u0027抗原分子；特异性强，可以从混合标本中正确鉴定出目的病原微生物，而且可从一个标本中同时检测几种核酸。

核酸探针诊断技术可用于所有病原体的特异诊断及分类鉴定；在混有大量杂菌或混合感染物中直接检出主要致病原，包括难以在体外培养的病原，检出隐性感染的动物，动物产品或食品的卫生检验。

但该技术由于操作复杂、耗时较长，特别是缺少商品化探针等原因，故仅用于科学研究，还从未在兽医临床诊断实践工作中应用过，因此无法与pcR技术相提并论。

(3)dNA芯片技术：

dNA芯片又称为基因芯片(gene chip)、微阵列(microarray)，属于生物芯片的一种。

根据微阵列上探针不同，dNA芯片又分为寡核苷酸芯片和cdNA芯片。

其技术和设备日趋成熟，在医学、遗传学等许多领域已有产品供应，例如筛选检测hIV蛋白酶基因和反转录酶基因突变的dNA芯片，某些癌症基因的诊断芯片，大肠杆菌、酵母的蛋白表达谱芯片，金黄色葡萄球菌、白色念珠菌dNA芯片等。

国外已有用于动物传染病诊断的报道，国内目前仍处于技术移植、探索和研究阶段，关键是试剂的商品化问题。